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QUADERNO ICARO n.17
LE RICERCHE DEL DNA NEL CANE

Michele Polli, Luigi Guidobono Cavalchini, Stefano Paolo Marelli

Universit� degli Studi di Milano - Istituto di Zootecnica - Facolt� di Medicina Veterinaria Via Celoria 10 - 20133 MILANO
Tel. 02/50318048
michele.polli@unimi.it
luigi.guidobonocavalchini@unimi.it

INTRODUZIONE

Gli studi sul DNA degli animali domestici, progrediscono molto rapidamente, grazie anche alla facilit� di interscambio di informazioni tra gli scienziati di tutto il mondo, come � risultato dalla 29� Conferenza Internazionale di Genetica Animale, tenutasi a Tokyo lo scorso settembre. Purtroppo le ricerche sul cane non sono cos� numerose poich� i progetti non sono sufficientemente considerati dai finanziamenti pubblici. Nonostante ci�, la buona volont� di molti ricercatori e l�interesse particolare legato all�ampia biodiversit� presente nelle popolazioni canine, permette un continuo miglioramento delle conoscenze delle mappe genomiche e dei marker utilizzabili, mentre pi� arduo � il cammino relativo all�identificazione dell�espressione dei geni.
Nella molecola del DNA sono presenti, oltre a tutte le indicazioni relative alla storia evolutiva di una specie, anche tutte le informazioni per la crescita e per lo sviluppo di un individuo. Nel DNA sono codificate alcune patologie ereditarie e troviamo anche le indicazioni riguardanti le difese immunitarie nei confronti delle malattie e la predisposizione ad ammalarsi ed inoltre tutte quelle informazioni relative alle reazioni comportamentali o ancora tutti i messaggi che codificano la durata della vita stessa fino alla morte.
Il DNA � quindi la molecola che indica nei dettagli la direzione per le infinite attivit� cellulari. Tutte le cellule di un determinato individuo contengono un identico DNA, che per� ha un'espressione genica differente a seconda del tipo cellulare. La diversit� tra le cellule � dovuta alla differente espressione genica del DNA che comporta una sintesi di differenti proteine responsabili di specifiche funzioni.
Nel cane il DNA � organizzato in 78 cromosomi localizzati all'interno del nucleo cellulare, da dove presiede alle innumerevoli attivit� riguardanti altre importanti strutture della cellula. Le cellule di un organismo animale sono all'incirca 1000 miliardi, all'interno di ognuna di esse � presente il medesimo DNA genomico, con una lunghezza approssimativa pari a 2 metri. Nel DNA genomico a seconda della specie animale sono contenuti circa 20.000-30.000 geni, anche se ultimamente in seguito ai risultati ottenuti con il mappaggio dei genomi dell�uomo e di altre specie animali, parrebbe che il numero effettivo dei geni codificanti per determinate proteine non sia cos� elevato.

Struttura della molecola del DNA

Il DNA � costituito da nucleotidi. Ogni nucleotide � a sua volta � costituito da una base azotata, da uno zucchero (desossiribosio) e da un gruppo fosforico. Le basi azotate del DNA si dividono in purine: adenina (A) e guanina (G) e pirimidine: citosina (C) e timina (T). Per visualizzare la struttura tridimensionale della molecola del DNA basta pensare ad una scala a pioli avvolta nel formare una spirale mantenendo i pioli perpendicolari all'asse di rotazione. I montanti della scala sono costituiti da molecole di zucchero e fosfato, mentre i pioli sono costituiti dalle basi azotate adenina (A), timina (T), guanina (G), citosina(C).

Organizzazione cellulare del DNA

Il DNA nelle cellule degli animali superiori (cellule eucariote) � organizzato in strutture chiamate cromosomi. Ogni cromosoma contiene dai 2 ai 4 centimetri di materiale genetico. Il numero, la forma e le dimensioni dei cromosomi sono caratteristiche tipiche per ogni specie animale. Ogni cellula contiene sempre due cromosomi identici: i cromosomi omologhi. Il numero di coppie di cromosomi omologhi (n) � tipico della specie, ed il nucleo cellulare contiene sempre 2n cromosomi di grandezza molto variabile. I cromosomi possono essere suddivisi in gruppi a seconda della forma ed in particolare a seconda della posizione del centromero (punto di incontro delle braccia). Esistono inoltre i cromosomi sessuali: nei mammiferi si parla di eterogametia maschile in quanto la femmina si caratterizza per un assetto cromosomico di tipo XX, possiede cio� due cromosomi sessuali X identici, mentre il maschio ha un assetto di tipo XY. Mentre il cromosoma sessuale Y � piuttosto piccolo e con differente forma a seconda delle diverse specie animali, il cromosoma sessuale X risulta in tutte le specie molto grande e pu� contenere fino a 4000 geni differenti.
L'insieme di tutte le caratteristiche costanti relative ai cromosomi costituiscono il cariotipo di una specie. Il cromosoma X � molto grande mentre il cromosoma Y risulta molto piccolo, ed entrambi sono submetacentrici. Sia per numero che per la forma i cromosomi del cane sono tra i pi� difficili da studiare, anche con le pi� moderne tecniche di citogenetica, per questo il cane � la sola specie che non possiede un cariotipo standard riconosciuto a livello internazionale. Per definire ed identificare meglio alcuni cromosomi del cane, oltre alle moderne tecniche di citogenetica, vengono attualmente utilizzate delle sonde microsatelliti che permettono di effettuare una mappatura fisica mediante l�innovativa tecnica FISH (Fluorescent In Situ Hibridization).

Genoma umano e genoma animale

Il DNA, umano ed animale, � lungo almeno 2 metri ed � costituito da circa 3.200.000.000 basi nucleotidiche (adenina, guanina, citosina, timina). Il genoma di un animale superiore � costituito da circa 30.000 geni, i 4 nucleotidi del DNA trascritti costituiscono, come esempio di paragone, 200 volumi di 1000 pagine ciascuno. Sempre come termine di paragone, il genoma del moscerino della frutta (Drosophila) sarebbe costituito da 10 volumi di 1000 pagine ciascuno, quello di un lievito da 1 volume di 1000 pagine, mentre il batterio Escherichia Coli, avrebbe un genoma corrispondente a 300 pagine.
Il concetto di gene � radicalmente mutato negli ultimi anni. Infatti, secondo le pi� recenti ricerche i geni effettivi degli animali superiori non sarebbero tanto numerosi quanto si riteneva fino a poco tempo fa, ma probabilmente con effetto combinatorio un pi� limitato numero di geni, tra loro interagenti, produrrebbe l�insieme degli effetti fenotipici che costituiscono la variabilit� genetica di un individuo.

Acquisire tutte le informazioni strutturali e funzionali dei genomi umano e animale � senz'altro una delle pi� ambiziose mete scientifiche degli ultimi anni. Mappare un genoma significa localizzare tutti i geni sui cromosomi prima di determinarne la funzione. L'applicazione principale e sicuramente pi� immediata sar� nelle diverse specie animali, quella di sviluppare dei test diagnostici per le principali malattie ereditarie o per identificare i geni responsabili per determinati fenotipi.

Mappaggio del genoma nel cane

Negli ultimi anni gli studi genetici riguardanti il cane si sono moltiplicati: attualmente sono 46 i laboratori internazionali costantemente impegnati nel "Progetto di Mappaggio del Genoma Canino" (http://mendel.berkeley.edu/), e sono sempre pi� numerose le applicazioni derivanti da questo studio per la comprensione a livello molecolare dei principali disordini genetici che interessano il cane. Fino ad oggi il progetto di mappaggio del genoma canino si � basato soprattutto sull'utilizzo dei microsatelliti (sequenze ripetute di due-tre o quattro nucleotidi) per la saturazione della mappa e l'identificazione di marcatori da correlare con i geni responsabili delle principali malattie genetiche. Si � ottenuta quindi una valida mappa genetica (fig. 1) che ha gi� consentito di identificare numerosi geni alla base di differenti malattie ereditarie che colpiscono le diverse razze canine. In particolare i marcatori microsatelliti hanno gi� permesso anche studi di filogenesi su razze canine che sono state selezionate in ecosistemi assai diversi e con differenti attitudini e con un ampia variabilit� morfologica. Il limite principale al mappaggio del genoma canino � rappresentato soprattutto dagli scarsi finanziamenti. Infatti per il cane � impensabile culturalmente e socialmente un superfinanziamento al pari di quello del genoma umano dove in definitiva si � ottenuta una mappa ad alta risoluzione nella quale � stato possibile sequenziare in modo completo i 3.200.000.000 di basi nucleotidiche che si susseguono nel genoma.

Fig. 1 - Mappa Genetica: si basa sulla ricerca di segregazione tra geni e marcatori microsatelliti

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Nel cane � invece per ora possibile ottenere una mappa a bassa risoluzione, basata sui marcatori genetici come i microsatelliti (fig. 1) che ci consentono comunque uno studio di linkage, ossia di correlazione tra i marcatori genetici ed i geni che sono coinvolti in determinate malattie genetiche. Nel cane quindi per ora viene identificato un microsatellite o un determinato marcatore che � correlato al gene difettoso e quindi il genotipo del microsatellite ci rivela la variante allelica responsabile del disordine genetico. Va per� considerato che anche a livello del genoma del cane sono gi� molti i geni sequenziati dei quali perci� si � gi� ottenuta una mappa ad alta risoluzione. Inoltre va ricordato che i geni nelle differenti specie animali hanno un elevato grado di conservazione e pertanto il mappaggio del genoma umano consente di procedere al sequenziamento degli altri genomi animali in modo molto veloce. Si tratta pertanto di sfruttare al meglio le cosiddette "mappe comparative" tra le differenti specie animali.
L�identificazione di un gene, ed il riconoscimento di varianti alleliche difettose riscontrate in una specie animale, consente pertanto un pi� rapido riconoscimento e studio di tali varianti anche nelle altre specie animali. Proprio per questi motivi si pu� prospettare che il genoma del cane verr� mappato (mappa ad alta risoluzione) indipendentemente dai superfinanziamenti utilizzati per il genoma umano in tempi relativamente brevi. Inoltre l�acquisizione delle conoscenze relative al genoma del cane, permette uno studio comparato del genoma umano. Pertanto in modo reciproco si possono ottenere importanti informazioni che in uno studio indirizzato ad una sola specie animale sarebbero impossibili da ottenere.
Va ricordato inoltre che partendo dall'assunto che il cane pu� essere considerato il migliore "modello biologico" di studio utile all'uomo, per la comprensione di molti disturbi genetici, ed esistendo un rapporto diretto tra malattia genetica e razza � sicuramente verosimile che le analisi app

Principali applicazioni delle tecniche del DNA all�allevamento del cane di razza

In medicina veterinaria i possibili campi di applicazione della biologia molecolare sono vari e numerosi.
Fra i settori nei quali le moderne tecniche del DNA offrono grandi possibilit� un posto di rilievo spetta indiscutibilmente a quello dell�allevamento e della selezione del cane di razza.
A tal proposito un particolare rilievo va dato al controllo genetico della parentela, allo studio della variabilit� genetica e dell�eredit� patologica, all'identificazione delle varianti alleliche responsabili per determinati fenotipi (morfo-funzionali) che possono interessare la selezione di una determinata razza canina.
Le tecniche di biologia molecolare e le recenti scoperte legate al mappaggio dei genomi aprono nuovi orizzonti in tutto l�ambito zootecnico, basti in tal senso pensare alla possibilit� di allestire dei test diagnostici, basati sullo studio del DNA, che consentono in modo sicuro il riconoscimento di soggetti portatori di un determinato difetto genetico e quindi la messa in opera di piani selettivi mirati che permettono in tempi brevi la completa eradicazione del difetto dall�allevamento.

Il controllo genetico della parentela

Di recente in Italia, come nel resto del mondo occidentale, l�applicazione delle tecniche di biologia molecolare alla selezione e all�allevamento del cane di razza che sembra avere maggiore rilievo � quella relativa al controllo genetico della parentela. Grazie all'identificazione certa dei riproduttori, mediante lo studio del loro DNA, si ottiene una valorizzazione del libro genealogico che rappresenta uno strumento fondamentale per la selezione e l'allevamento del cane di razza. E� infatti oggi dimostrato che tutti gli studi selettivi ed i piani di controllo volti all�eliminazione delle malattie genetiche sono sicuramente destinati a fallire se non esiste la certezza assoluta dell'identificazione dei riproduttori.

Fig 2 - Controllo genetico della parentela presso l�Istituto di Zootecnica dal 1996 al 2003: L�attivit� maggiore � stata svolta per l�ENCI e in modo pi� limitato per gli allevatori e privati, per la Centrale di Lettura delle Malattie Scheletriche di Ferrara, per i Tribunali e per la Polizia di Stato.

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A tal proposito, da alcuni anni, presso l'Istituto di Zootecnica della Facolt� di Medicina Veterinaria di Milano vengono effettuate su richiesta dell�ENCI le diagnosi di parentela (fig. 2-3-8).

Fig 3 - Diagnosi di parentela su richiesta dell�Ente Nazionali della Cinofilia Italiana dal 1997 al 2003. Le diagnosi sono state richieste per vizi di forma all�atto della registrazione delle cucciolate al Libro Genealogico. Sono stati richiesti 705 controlli di gruppi familiari per un totale di 4119 soggetti. (vedi figura 4)

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La maggior parte delle richieste finora inoltrate provengono direttamente dall'Ente Nazionale dellaCinofilia Italiana, nell'ambito di un controllo sperimentale per l'iscrizione al libro genealogico. Tale controllo � stato riservato, fino ad ora, a tutte quelle cucciolate per le quali � stata riscontrato un vizio di forma all�atto della registrazione al libro genealogico. Altre richieste sono state inoltrate da allevatori e privati, al fine di verificare la parentela di particolari soggetti in selezione; infine alcune richieste, relative a controversie tra allevatori, sono pervenute dalla Polizia di Stato e da alcuni tribunali.
I risultati dei controlli fino ad oggi commissionati dall'Ente Nazionale della Cinofilia Italiana dimostrano che in media il 7,5 % dei cuccioli esaminati non corrisponde al padre dichiarato dall'allevatore (fig. 4-5-7).

Fig 4 - L�Enci dal 1997 fino a met� del 2003 ha richiesto l�analisi di 4119 cani, ma si sono sottoposti al controllo solo 714 soggetti.

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Per quanto riguarda i test richiesti direttamente dagli allevatori, in particolari situazioni in cui l'allevatore non era certo dell'identit� dello stallone, si � visto che il 53,8% dei cuccioli non corrisponde al presunto padre (fig. 6).
Bisogna comunque specificare che la percentuale di errore osservata non pu� essere considerata rappresentativa di un vero e proprio controllo statistico, in quanto si basa su diagnosi di parentela effettuate su commissione dell�ENCI o di privati, in casi quindi che a monte sono passibili di controversie, ma rappresenta sicuramente una chiara indicazione e mostra l'importanza dell'app

Lo studio della variabilit� genetica e filogenesi

Tradizionalmente gli studi relativi alla selezione delle razze canine si basavano sull�analisi dei fenotipi. L�insieme delle caratteristiche sia morfologiche che funzionali e comportamentali che costituiscono il fenotipo di un determinato individuo, sono interessante materia di studio sottoposta per� a valutazioni estremamente soggettive. Uno dei vantaggi delle tecniche del DNA e delle nuove acquisizioni di genetica molecolare � che esse permettono di studiare direttamente il genoma canino e di effettuare studi di carattere filogenetico, che ricostruiscono il cammino evolutivo delle diverse razze, analizzando direttamente le loro distanze genetiche. Grazie all�impiego di particolari sequenze di DNA chiamate "microsatelliti" � oggi possibile monitorare in modo preciso fenomeni quali la perdita di eterozigosit� e l'erosione genetica, nonch� calcolare i coefficienti di consanguineit� all'interno di una determinata popolazione canina. Le tecniche di studio del DNA consentono inoltre l�identificazione genetica delle razze canine, dimostrando in modo efficace la loro identit� ed origine e permettendo un riconoscimento oggettivo della loro storia evolutiva. Un metodo alternativo per gli studi di filogenesi � basato sull'analisi del DNA mitocondriale. L'attivit� mitocondriale � alla base del processo per la produzione di energia a livello cellulare. I mitocondri producono gli enzimi necessari alla respirazione cellulare e contengono anch'essi una piccola quantit� di DNA. Tale DNA, a differenza di quanto avviene per quello genomico, � trasmesso esclusivamente attraverso la linea cellulare germinale femminile ed ha la caratteristica di mutare rapidamente nel tempo. Il genoma mitocondriale, ereditato solo per via materna in forma aploide, ha inoltre la caratteristica di non andare incontro a fenomeni di ricombinazione. Proprio per queste caratteristiche � considerato da molti ricercatori un migliore "contatore del tempo" rispetto al DNA genomico nucleare, anche se purtroppo le mutazioni avvengono con intervalli di tempo incostanti. Nel DNA mitocondriale, e soprattutto a livello della regione "d-loop" (ipervariabile), sono quindi reperibili delle "tracce del passato" complementari e in alcuni casi, pi� informative rispetto a quelle reperibili con i microsatelliti del DNA genomico nucleare. Le variazioni della sequenza d-loop combinate alla assenza di ricombinazione costituiscono uno strumento altamente informativo per tutti gli studi matrilineari relativi ad una determinata specie. E' stato stimato che le sostituzioni nucleotidiche a livello del DNA mitocondriale sono 5-10 volte maggiori rispetto al DNA nucleare, e che la regione d-loop presenta una percentuale di sostituzioni da 2 a 5 volte maggiori rispetto alle rimanenti regioni del DNA mitocondriale Attraverso lo studio del DNA genomico e mitocondriale (fig.10), � possibile ricostruire in modo assolutamente oggettivo, le tappe della storia evolutiva delle principali razze canine italiane. Dagli studi eseguiti presso l'Istituto di Zootecnica della Facolt� di Medicina Veterinaria di Milano su alcune razze canine, quali ad esempio il Bracco Italiano, il Dobermann ed il Pastore Tedesco, risulta una costante perdita di variabilit� genetica con la presenza di un�elevata consanguineit� (fig. 9).

Fig. 9 - Medie dei valori di PIC (polymorphism information content) ed eterozigosit� in alcune razze canine nel lupo e nella volpe. Il dobermann � la razza mostra una sensibile diminuzione della variabilit� genetica.

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Dagli studi genetici effettuati presso l�Istituto di Zootecnica della Facolt� di Medicina Veterinaria di Milano, analizzando il DNA mitocondriale e genomico, si �<

Lo studio dell'eredit� patologica

Mappare il genoma significa localizzare ed individuare tutte le sequenze del DNA sui cromosomi (fig.11).

Fig. 11 - Attraverso il sequenziamento del DNA � possibile tradurre i geni in sequenze di basi nucleotidiche, adenina, guanina, citosina e timina.
Nell�immagine, ottenuta con un sequenziatore automatico, i quattro nucleotidi corrispondono ai colori rosso, verde, giallo e blu.

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Lo studio delle malattie genetiche del cane fa un ampio utilizzo sia delle informazioni provenienti dalla mappa del genoma, sia da quelle che si ricavano dalle cosiddette mappe comparative, derivanti dal mappaggio degli stessi geni in altre specie animali. Proprio per questo il mappaggio del genoma del cane, traendo importanti informazioni anche dalle altre specie animali sta procedendo velocemente.
Quando il mappaggio del genoma canino verr� completato, saranno possibili sia l'identificazione dei geni responsabili di molte malattie ereditarie del cane, sia la comprensione di molti meccanismi genetici relativi alle malattie monogeniche e poligeniche.

La maggiore conoscenza del genoma canino consentir�, in tempi ragionevolmente brevi, sia di approntare numerosi test diagnostici per le principali malattie ereditarie, sia di identificare quelle varianti alleliche relative a determinati fenotipi che possono interessare la selezione del cane di razza. Gli studi per il riconoscimento del gene o dei geni �candidati� quali responsabili per molte malattie ereditarie del cane, utilizzano soprattutto la "mappa di linkage" (fig.1-12). Si tratta in pratica di riconoscere il legame genetico tra un marcatore, cio� un punto di riferimento sul genoma spesso rappresentato da una "sequenza microsatellite", ed il gene d'interesse. I geni responsabili per una determinata malattia vengono quindi identificati tramite il marcatore strettamente correlato al gene responsabile della malattia stessa. Una volta appurata la segregazione e cio� il legame genetico (linkage) tra il marcatore e la comparsa della malattia in molti gruppi famigliari, � possibile testare la popolazione canina per il marcatore stesso, eliminando i soggetti con il genotipo correlato alla presenza della malattia di interesse.
Con metodiche pi� costose e raffinate � inoltre possibile sequenziare il gene responsabile per una determinata malattia genetica. Il sequenziamento � una procedura che permette di tradurre il susseguirsi delle basi nucleotidiche del DNA, che alternandosi tra di loro costituiscono l'insieme dei geni. Diventa quindi possibile confrontare le sequenze di un determinato gene tra individui diversi e controllare la presenza di mutazioni che, anche se costituite dalla semplice sostituzione di una base nucleotidica, rappresentano il difetto genetico responsabile di importanti malattie.
E' poi possibile allestire dei test genetici che permettono in modo efficace, in seguito all'analisi del DNA, di distinguere i soggetti sani da quelli malati e dai portatori. E� questo un aspetto di grande interesse in quanto spesso le malattie genetiche si manifestano tardivamente, presentandosi magari in riproduttori in fase di piena attivit�. I test del DNA sono invece in grado di riconoscere precocemente il soggetto malato o portatore, indipendentemente dall'avvenuta espressione fenotipici della malattia.

Fig. 12a - Il sequenziamento permette di verificare una mutazione a livello della sequenza di un gene.

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Identificazione dei geni responsabili per determinati fenotipi

Utilizzando le stesse tecniche impiegate per l'identificazione dei geni responsabili delle malattie genetiche, � oggi possibile identificare le varianti alleliche responsabili per alcuni caratteri morfo-funzionali.
Applicando questi test sui riproduttori diventa possibile, ad esempio, stabilire quali saranno le caratteristiche fenotipiche relative al colore del mantello nella prole (Canine Coat and Nose Color and Mask DNA Testing) (tab. 2-3).
Per il momento la disponibilit� di questi test riguarda poche razze canine. Ma anche in questo caso, in relazione ai progressi relativi al mappaggio del genoma del cane, si renderanno presto disponibili molti test riguardanti, nelle diverse razze canine, sia gli aspetti morfo-funzionali che quelli comportamentali.
Attualmente le razze interessate da tali test sono: Labrador Retriever, Dobermann Pinscher, American Cocker Spaniel, Flat-coated Retriever, Poodle, Scottish Terrier, Boxer, Curly-Coated Retriever, Dachshund,, Great Dane, Pomeranian, Whippet. (Tab 2)

TAB.2 - Razze canine per le quali � gi� disponibile un test del DNA relativo alla colorazione del mantello

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TAB.3 - Nel Labrador Retriever attraverso il test del DNA � possibile identificare il genotipo relativo alla colorazione del mantello, in modo tale da programmare gli accoppiamenti dei riproduttori in base al mantello che si desidera ottenere nelle cucciolate.
(http://www.healthgene.com/color/index.asp)
(http://www.vetgen.com/services.html)

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Nel prossimo futuro grazie ai rapidi progressi riguardanti il mappaggio del genoma del cane molte malattie genetiche, quali la displasia dell'anca, l'atrofia progressiva della retina, la cataratta, l'epilessia, le cardiomiopatie e la sordit�, potranno essere diagnosticate precocemente e quindi eliminate dagli allevamenti. Ci� potr� avvenire grazie all�identificazione sia dei soggetti portatori che dei soggetti ammalati che non hanno ancora manifestato la malattia. In tempi relativamente brevi, le nuove tecniche di biologia molecolare permetteranno di ottenere grandi risultati nell�ambito della selezione del cane di razza. Tali risultati per� non potranno prescindere, come gi� indicato precedentemente, dall'applicazione sistematica del controllo genetico della parentela, che costituisce con il libro genealogico un presupposto fondamentale per una selezione del cane di razza particolarmente attenta alla sua salute e di al suo benessere.

Bibliografia

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